APS | Shank2基因DNA过度甲基化参与新生期多次七氟烷麻醉诱导雄性小鼠神经发育毒性和认知功能缺陷

导   读

临床麻醉为外科手术患者提供重要保障，麻醉药厥功至伟。长期以来，人们普遍认为麻醉状态是安全的和可逆的，无任何不良后果。随着患者的年龄向两个极端扩展，人们逐渐发现麻醉药可能产生远期的不良后果。对于老年人，麻醉药可能引起神经退行性疾病；对于婴幼儿，麻醉药可能诱发神经发育类疾病。综合大量的临床调查和基础研究发现：麻醉药影响认知功能状态和神经行为表型呈现异质性，即麻醉药神经毒性对易感人群和临床表型具有“选择性”。探索麻醉药诱导神经毒性及远期效应，不但应考虑药物浓度、暴露时长和麻醉次数，还需要从不同维度提出科研假设和验证因果关系。迄今，表观遗传修饰对调控七氟烷麻醉诱导神经毒性的作用尚不清楚。因此，本研究从甲基化修饰角度探索麻醉药诱导神经发育毒性的机制，以期为临床筛选易感人群和指导合理用药提供理论依据。

Graphic Abstract

正   文

既往研究提示：表观遗传修饰（DNA甲基化、组蛋白修饰和RNA干扰等）可影响多种基因的蛋白表达水平，引起神经元兴奋性和动物行为学的异常。大脑发育过程中，DNA甲基化对精确调控神经认知功能至关重要。各种药物和神经损伤皆可能影响DNA甲基化稳态失衡，最终损害认知功能。麻醉药诱发的认知功能损害可能涉及表观遗传修饰，但是具体机制尚不清楚。

关于七氟烷诱导神经毒性的病理学机制，仅采用麻醉药主要受体（NMDAR和GABAR）蛋白表达变化，不足以解释认知功能障碍和神经行为异常的机制。据文献报道：由Shank1、Shank2和Shank3基因编码的SHANK蛋白表达变化与多种神经发育障碍有关，包括以社会交往行为缺陷为代表的自闭症谱系障碍（ASD）。因此，神经发育类疾病的临床表型，可能是由多种基因和蛋白质相互作用的结果。

本团队推测新生期麻醉可能下调谷氨酸受体、神经元活动和神经行为表现所必需的SHANK蛋白家族。为验证该假设，研究人员培育新生期小鼠，给新生期小鼠多次七氟烷麻醉，利用三室社会交往实验和Morris水迷宫检测小鼠的社会交往行为和学习记忆能力。为验证其行为学变化的潜在机制，研究人员检测小鼠海马SHANK蛋白的表达水平、分析Shank基因的表观遗传机制，并检测DNA甲基化酶在海马组织的表达变化。

（1）新生期多次七氟烷麻醉损害小鼠的社会识别记忆和学习记忆能力

本研究给新生期小鼠实施多次七氟烷麻醉，然后采用三室社会交往模型测试小鼠幼年期社会交往行为，结果发现：新生期麻醉不影响小鼠的社会交往倾向（Sociability），但是显著降低小鼠的社会新奇偏好（Preference for social novelty）。此外，新生期麻醉组小鼠在水迷宫实验（Morris water maze）中表现出寻找平台时间显著延长和穿越平台次数显著减少。由此可见：新生期麻醉可损害小鼠社会识别记忆能力和空间学习记忆水平。

图1 新生期多次七氟烷麻醉损害小鼠的社会识别记忆和空间学习记忆 (A)实验流程图，实验小鼠在P6-8接受七氟烷麻醉，在P30-36完成行为学测试，在P37被提取海马组织。在社会交往倾向测试中，七氟烷麻醉组小鼠表现较强的社会亲和能力，其花费更多时间(B)和次数(C)嗅探第一只陌生同类小鼠。在社会新奇偏好测试中，七氟烷麻醉组小鼠表现较弱的社会记忆水平，其在两侧房间围笼边嗅探时间(D)或嗅探次数(E)无显著性差异。(F)七氟烷麻醉小鼠寻找平台时间增加。(G)七氟烷麻醉小鼠穿越平台次数减少。(H)七氟烷麻醉小鼠在第四象限停留时间减少。(I)两组实验小鼠在游泳速度上无显著性差异。

鉴于新生期麻醉小鼠表现远期社会记忆缺陷与学习记忆障碍。本研究提取出生后第37天小鼠海马进行全转录组测序（RNA-seq），结果发现：与对照组比较，麻醉组小鼠海马有314个差异性表达基因（DEGs），包括上调基因49个，下调基因265个。GO分析显示：Shank2基因与学习、记忆和社交行为密切相关。

图2   新生期多次七氟烷麻醉降低小鼠海马Shank2基因的转录和翻译，并减少其海马CA1区神经元的自发兴奋性突触后电流(sEPSCs)   七氟烷麻醉可降低海马SHANK2(B) mRNA的转录水平，但是不影响SHANK1(A)和SHANK3(C) mRNA的转录水平。(D)免疫印迹显示七氟烷麻醉降低海马SHANK2蛋白的表达水平。(E)定量分析显示，七氟烷麻醉降低海马SHANK2蛋白表达水平(N=5)。(F)七氟烷麻醉小鼠海马CA1区神经元代表性的sEPSCs描计图。七氟烷麻醉降低海马神经元sEPSCs的振幅(G, I)和频率(H, J)。

本研究利用RT-PCR技术检测小鼠海马SHANK蛋白家族mRNA的转录水平，结果发现：新生期麻醉显著降低海马Shank2基因的mRNA转录水平，但是Shank1和Shank3 mRNA转录水平未见显著变化。随后，本研究利用Western blot检测小鼠海马SHANK2蛋白的表达水平，结果发现：新生期麻醉显著降低海马SHANK2蛋白的表达水平。此外，本研究制作小鼠大脑组织切片，进行膜片钳电生理记录并发现：新生期多次七氟烷麻醉显著降低海马CA1区锥体神经元的自发兴奋性突触后电流（sEPSCs）的频率和幅度。

图3   全基因组重亚硫酸氢盐测序(WGBS)中差异甲基化区域(DMRs)   (A) CG甲基化核密度图。两条曲线表示重亚硫酸氢盐将核苷酸从未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的效率。(B)差异甲基化区域的统计分析显示，CG序列背景中有150个DMRs上调，450个DMRs下调。(C)前100个差异甲基化区域的热图。颜色被标记为从最低(蓝色)到最高(红色)的差异甲基化强度。(D) KEGG富集分析显示前20个信号通路。颜色表示q值从最低(红色)到最高(蓝色)，气泡大小表示单个途径中显著变化基因的数量。

在明确Shank2基因mRNA和蛋白的表达水平降低后，本研究探讨表观遗传调控在七氟烷麻醉诱导Shank2基因表达下调中的作用，结果发现：在CG序列基因组DNA有600个差异性甲基化区域（DMRs），包括150个上调甲基化区域和450个下调甲基化区域。GO功能分析发现：Shank2基因存在差异甲基化区域(Gene lD: ENSMUSG00000037541)。KEGG通路富集分析显示：Shank2基因位列于谷氨酸突触通路中。

图4   新生期多次七氟烷麻醉降低P37小鼠海马Tet家族的mRNA水平   七氟烷麻醉后P37小鼠海马区DNA甲基转移酶(DNMTI (A)、DNMT3a (B)、DNMT3b (C))、甲基结合蛋白(MBDI (D)、MBD2 (E)、MBD4 (F))和DNA去甲基化酶TDG (G) mRNA水平无明显变化。RT-PCR分析显示，七氟烷麻醉后P37小鼠海马区TET1(H)、TET2 (I)、TET3 (J)DNA羟甲基化酶mRNA的转录水平明显降低。

鉴于Shank2基因存在差异性甲基化区域，本研究深入探索Shank2基因DNA过度甲基化的上游机制。本研究采用RT-PCR技术检测甲基化酶（Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b）、甲基化结合域蛋白（Mbd1, Mbd2, Mbd4）、DNA去甲基化酶（Tdg）和羟甲基化酶（Tet1, Tet2, Tet3）的mRNA的转录水平，结果发现：新生期麻醉显著降低Tet mRNA的转录水平。然后，本研究采用Western blot检测小鼠海马TET蛋白的表达水平。结果发现：新生期麻醉显著降低TET3蛋白的表达水平，但是TET1和TET2蛋白的表达未见显著性变化。综上所述，新生期多次七氟烷麻醉可降低小鼠海马区TET家族的mRNA水平，并降低TET3蛋白水平，从而增加DNA甲基化水平，即造成Shank2-DNA甲基化稳态失衡。

图5      新生期接受多次七氟烷麻醉会降低P37小鼠海马中TET3蛋白水平(A)免疫印迹显示七氟烷麻醉不改变P37小鼠海马TET1蛋白表达水平。(B)免疫印迹定量显示七氟烷麻醉不改变海马TET1蛋白表达水平。(C)免疫印迹显示P37小鼠在P6-8接受七氟烷麻醉不改变海马TET2蛋白表达水平。(D)免疫印迹定量显示七氟烷麻醉不改变海马TET2蛋白表达水平。(E)免疫印迹显示新生期七氟烷麻醉可降低小鼠海马TET3蛋白表达水平。(F)免疫印迹定量显示七氟烷麻醉显著降低小鼠海马TET3蛋白表达水平。

总结与展望

本研究利用C57BL/6小鼠模型，从行为学发现新生期多次七氟烷麻醉损害小鼠远期社会识别记忆和空间参考记忆。七氟烷减少突触骨架蛋白SHANK2和DNA羟甲基化酶TET3蛋白的表达水平。SHANK2蛋白表达水平降低与谷氨酸突触途径中的海马神经元兴奋性异常相关。TET3蛋白表达水平降低与Shank2基因DNA过度甲基化有关，SHANK2蛋白表达降低参与七氟烷麻醉诱导的神经毒性。本研究开启从表观遗传修饰角度研究麻醉药诱导发育期神经毒性的新思路，这些结果将为开发精准靶向基因药物防治麻醉药诱发神经行为缺陷提供理论依据。

扫描二维码｜查看原文

作者简介

杨建平（通讯作者）

主任医师、医学博士、教授、博士生导师。苏州大学附属独墅湖医院副院长，麻醉学、疼痛治疗和危重症医学科学术带头人。主要研究方向：疼痛产生机制以及镇痛基础和临床研究。

金   鑫（通讯作者）

主任医师、医学博士、讲师、硕士生导师。苏州大学附属独墅湖医院，麻醉与疼痛医学科。研究方向：麻醉药诱导神经发育毒性。

宋绍永（第一作者）

住院医师、医学博士、讲师、硕士生导师。苏州大学附属独墅湖医院，麻醉与疼痛医学科。研究方向：麻醉药诱导神经发育毒性。